RNA测序

RNA测序通常简称为 RNA-seq，是一类用于确定生物样本中RNA分子的序列及相对丰度的方法。它用于研究转录组——特定条件下存在的全部RNA转录本——以及基因表达、转录本结构和样本间的差异。大多数方法在测序前先将RNA转化为互补脱氧核糖核酸（cDNA），而直接RNA测序则读取天然RNA分子。RNA-seq不仅可以测量表达水平，还能揭示剪接接头等传统表达芯片难以检测的特征。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

生物学基础与测量

RNA-seq对转录（生物学）及后续RNA加工的产物进行采样。根据所用方案，它可以分析信使RNA、非编码转录本或特定类别的小RNA。获得的序列能够提供证据，说明哪些基因正在表达，以及存在哪些转录本形式。跨越外显子边界的测序读段可用于识别RNA剪接事件，包括可变剪接。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

RNA-seq读段是一次序列观测，并不天然等同于一个原始RNA分子的计数。片段化可将一个转录本变成多个可供测序的片段，而扩增又可产生同一片段的多个副本。因此，丰度估计取决于文库制备、转录本长度、采样深度，以及对归属不明确的读段所采用的计算处理方法。与序列组成和片段位置相关的技术偏倚也会影响测量结果。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

实验流程

典型的基于互补DNA的实验包括以下几个阶段：

RNA提取与质量评估。 从样本中分离RNA，并评估其含量和完整性。对于已降解的RNA或起始材料量极少的样本，需要采用适应这些限制的方法。
富集或去除。 多聚腺苷酸〔poly(A)〕富集通过捕获多聚腺苷酸尾，将许多信使RNA富集起来。另一种方法是去除核糖体RNA，从而保留种类更广的转录本混合物。这两种方法所保留的RNA群体不同。
文库构建。 将RNA转化为互补DNA。根据具体方法，片段化可发生在这一转化之前或之后。随后加入测序接头和样本标识，许多流程还使用聚合酶链式反应进行扩增。
测序。 使用DNA测序平台读取文库。
计算分析。 评估读段质量，将读段归属到基因组或转录本序列，并用于丰度估计或转录本发现。(nature.com)

文库设计决定了数据能够回答哪些问题。链特异性方法保留转录本来源链的信息，有助于区分相互重叠的转录本。对转录本末端进行测序的方法侧重于基因层面的定量，而覆盖转录本更广区域的方法则能提供更多有关内部结构和剪接模式的证据。“总RNA”测序并不意味着对每类RNA都能同样有效地回收；去除、片段大小筛选及其他制备步骤仍会影响最终观测到的RNA群体。(nature.com)

主要方法

**群体RNA测序（bulk RNA-seq）**测量的是来自许多细胞的混合RNA。其表达谱综合了样本中各种细胞类型的信号。因此，组织之间的差异可能反映细胞内部表达水平的变化、细胞类型比例的变化，或两者兼有。(nature.com)

**单细胞RNA测序**将表达测量结果归属到单个细胞。条形码用于识别细胞，许多方法还使用唯一分子标识符，帮助区分捕获到的分子与扩增产生的副本。这些方法可以揭示细胞异质性，但测量数据较为稀疏：在某个细胞中未检测到某种转录本，并不必然证明它在生物学上不存在。(nature.com)

长读长RNA测序对较长的互补DNA或RNA分子进行测序，为单个转录本内剪接接头的组合提供更直接的证据。直接RNA测序是另一种与之有所交叉的方法，它让天然RNA通过纳米孔，并根据电信号的变化推断序列。这种方法无需对代表RNA的扩增DNA进行测序，还可以保留与RNA修饰有关的信息，不过解读这类信号需要适当的模型和验证。(nature.com)

**空间转录组学**包括一类基于测序的方法，通过为捕获的转录本添加位置条形码，将表达测量结果与组织切片中的位置关联起来。空间分辨率取决于捕获系统：一个测量位置可能涵盖多个细胞，而非对应单个细胞。其他空间转录组技术则采用成像而非测序。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

计算分析

读段可以比对到参考基因组或转录组。基于基因组的分析采用能够识别剪接的比对方法，以处理跨越外显子连接处的读段。基于转录组的方法则估计哪些已注释转录本可能产生了观测到的片段。当多个转录本含有相同序列时，读段归属便存在不确定性；概率方法会将证据分配给与之相容的转录本。转录本组装还可以根据已比对的读段重建候选转录本。(nature.com)

输出结果可以是基因层面的计数表、转录本层面的丰度估计、剪接接头测量结果，或重建的转录本结构。基因层面的汇总通常比区分相似的转录本异构体更容易，因为多个异构体共有的读段仍可能识别出它们所属的共同基因。基准评估表明，分析性能取决于具体任务，而转录本层面的定量尤其具有挑战性。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

归一化用于处理测序深度和样本组成的差异。每百万转录本数（TPM）是在校正转录本长度并对样本总量进行缩放后表示丰度的指标。基于计数的条件间比较则通常采用样本特异的缩放因子。这些指标服务于不同目的：归一化后的表达值不应被视为可以与特定统计模型所需的计数输入互换。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

差异表达与实验设计

差异表达分析考察不同条件下的RNA丰度是否存在系统性差异。DESeq2等方法采用计数服从负二项分布的广义线性模型，以处理超出简单泊松采样所预期的变异。这些方法估计效应大小并进行统计假设检验，还常常利用不同基因之间的共享信息，在重复样本数较少时使估计更稳定。由于要检验许多基因，分析通常会控制错误发现率。统计显著性与表达变化幅度是两个不同的量。(pmc.ncbi.nlm.nih.gov)

生物学重复是实验设计的核心。增加测序读段可以改善采样，但不能替代独立的生物学样本。在单细胞比较中，来自同一个体的细胞并不等同于彼此独立的个体。一种称为**伪群体分析（pseudobulk analysis）**的方法，将每个生物学重复中某一细胞类型的计数汇总起来，再比较不同重复。忽略重复样本间变异的方法可能产生假阳性发现。(nature.com)

实验室、制备方案和测序批次之间的技术差异可能影响结果。参考材料、一致的处理流程和有记录可查的分析程序有助于提高可复现性，但仅靠归一化并不能消除所有技术偏倚。(nature.com)

历史与应用

2008年发表的多项研究确立了高通量测序作为转录组测量的实用方法。Mortazavi及其同事展示了哺乳动物转录本的定量分析，以及对跨越剪接位点读段的直接检测。2009年，Tang及其同事报道了单个细胞的全转录组信使RNA测序。此后的进展包括2016年出现的基于测序的空间转录组技术，以及2018年的高度并行化纳米孔直接RNA测序。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

其应用包括比较不同实验条件下的表达水平、识别此前未注释的转录本、分析可变剪接，以及检测候选融合转录本或已表达的序列变异。单细胞方法能够区分异质性细胞群体中的表达程序，而空间方法则将这些程序与组织结构联系起来。不同应用对测序深度、读长、文库制备和分析方法提出不同要求。(nature.com)

局限性与结果解读

RNA-seq对不同转录本的回收效率并不相同。RNA降解、扩增、序列组成、转录本长度和制备过程中的化学因素，都可能使覆盖度或丰度估计产生偏差。低丰度转录本更难检测，而相似序列可能使读段无法明确归属。增加测序量可以降低采样的不确定性，但其本身既不能消除系统性的制备偏倚，也不能解决所有共有序列的归属问题。(nature.com)

表达差异还需要从生物学角度加以解释。在群体样本中，细胞组成的变化可能呈现出类似调控变化的表现。在单细胞研究中，稀疏采样和细胞之间的相关性会影响统计推断。转录本发现和已表达变异检测的误差特征不同于基因层面的定量，因此，为某一任务验证过的分析流程，并不自动适用于另一任务。(nature.com)