冷冻电子显微镜技术（cryo-EM）是一类利用电子显微镜在低温条件下观察样品的技术。在生物学应用中，快速冷冻可将蛋白质、分子组装体或细胞材料包埋在玻璃态冰中，无需常规的脱水或重金属染色处理，即可保存其水合状态下的结构。记录的图像可用于通过计算重建三维结构。冷冻电镜涵盖多种方法，尤其包括单颗粒分析和冷冻电子断层成像，而非一种统一的实验流程。(ebi.ac.uk)
物理原理与样品制备
生物冷冻电镜通常使用透射电子显微镜，让加速后的电子穿过薄层样品。电子与样品的相互作用既能提供结构信息，也会造成辐射损伤。降温能将损伤限制在足以进行低剂量成像的程度，但并不能使样品免受辐射影响。因此，单幅图像中的信号很弱，精细结构的恢复依赖于对大量观测结果的整合。(grigoriefflab.umassmed.edu)
样品制备的核心过程是玻璃化：以足够快的速度冷却水，防止冰晶形成。晶态冰可能遮蔽颗粒并破坏样品的组织结构，而玻璃态冰则将水合材料固定在非晶态固体中。常见的操作是将少量样品加到带有支撑膜的金属载网上，去除多余液体，然后将载网迅速浸入由液氮冷却的液态乙烷中。样品在转移和成像过程中始终保持低温。(grigoriefflab.umassmed.edu)
冰层厚度、颗粒浓度、聚集情况和取向都会影响图像质量及其可用性。冰层既要能容纳颗粒，又必须足够薄，以便电子有效透过。玻璃化样品虽然常被描述为“接近天然状态”，但它仍是经实验制备的冷冻样品，而不是可被连续观察的活体系统。(grigoriefflab.umassmed.edu)
单颗粒重建
单颗粒分析通过同一种组装体的许多个独立副本在不同取向下的图像，重建其结构。因此，“单颗粒”指的是分析对象，而不是仅凭一个分子进行重建。与X射线晶体学不同，这种方法不要求分子形成有序晶体。重建过程需要解决的问题之一，是估计含噪颗粒图像中起初未知的取向。(nobelprize.org)
典型的计算流程首先对记录的电影序列中的各帧进行对齐，以校正样品运动。随后，软件识别颗粒、提取颗粒图像，并估计显微镜的衬度传递函数；该函数描述成像条件如何改变空间信息。二维分类将相似视角的图像归为一组，并帮助剔除不适用的图像。之后，通过反复估计颗粒取向和结构参数，对初始三维密度图进行精修。(arxiv.org)
重建是一个涉及图像处理、统计学和数值优化的逆问题。一些方法利用贝叶斯推断处理取向的不确定性，并对重建结果施加约束。三维分类可以区分组成或构象不同的颗粒，但柔性区域和连续的结构变化会使这种区分更加复杂。最终得到的密度图反映了所选颗粒群体及处理模型所保留的信息。(arxiv.org)
断层成像及相关方法
冷冻电子断层成像在一系列倾斜角度下记录同一样品，并重建三维体数据，即断层重建图。它可以研究细胞内部的组装体，保留可能在纯化过程中丢失的空间关系信息。对于重复出现的复合物，可以从断层重建图中提取其子体积，并通过子断层平均将它们合并，以提高结构细节的清晰度。(cryoem.wisc.edu)
较厚的细胞样品可能需要减薄，例如采用低温聚焦离子束铣削。常规倾转序列采集无法覆盖所有观察角度，因此会留下“缺失楔”区域的信息空缺，使重建结果受到方向相关的限制。此外，断层成像还必须将有限的电子照射剂量分配到同一样品的多幅图像中。(journals.iucr.org)
其他方法包括利用丝状结构中重复排列特征的螺旋重建，以及研究有序阵列的电子晶体学。这些方法都采用低温成像，但并不意味着它们的图像采集或重建方法相同。(ebi.ac.uk)
历史发展
现代冷冻电镜的发展得益于样品保存、显微技术和计算方法等方面相互促进的进步。约阿希姆·弗兰克开发了将独立颗粒的图像合成为三维重建结果的方法。雅克·杜博歇及其同事在20世纪80年代初建立了适用于水性样品的实用玻璃化方法。理查德·亨德森对细菌视紫红质的研究表明，电子显微镜能够测定原子分辨率的蛋白质结构；其中一项重要成果发表于1990年。(nobelprize.org)
直接电子探测器、基于电影序列的运动校正、仪器改进以及计算方法的发展，推动了此后的“分辨率革命”。2017年诺贝尔化学奖共同授予杜博歇、弗兰克和亨德森，以表彰他们发展冷冻电镜技术，使生物分子结构得以高分辨率测定。2020年，一项分辨率达到1.25埃的去铁铁蛋白重建成果，展示了在极为有利的条件下直接观察单个原子的能力；这并不意味着所有样品都能常规达到这一分辨率。(nobelprize.org)
分辨率、验证与应用
冷冻电镜的分辨率描述的是能够恢复的结构细节，而不只是放大倍数。一种常见的评估方法是使用傅里叶壳相关，比较两幅独立精修的半数据集密度图在不同空间频率下的相关性。报告单颗粒分辨率时，广泛采用0.143作为阈值。然而，全局分辨率数值可能掩盖不同区域之间的显著差异，掩膜处理或过拟合也可能影响表观一致性。因此，原子模型验证还需检查坐标是否与密度图吻合，以及是否符合合理的分子几何关系。(ebi.ac.uk)
冷冻电镜的应用对象涵盖核糖体、病毒、膜复合物、离子通道和酶等。它能够揭示组装体的组织结构、构象差异和结合相互作用，但可达到的细节程度取决于样品质量、结构稳定性和成像条件。重建的三维体数据存档于电子显微镜数据库，相应的原子坐标则提交至蛋白质数据库；密度图与拟合模型仍是不同的产物，前者属于实验结果，后者属于对实验结果的解释。(nobelprize.org)