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科学 / spliceosome

剪接体

剪接体是一种动态的RNA–蛋白质复合物，在真核基因表达过程中去除信使RNA前体中的内含子并连接外显子。

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蛋白质真核生物RNA剪接信使RNA内含子外显子三磷酸腺苷磷酸二酯键剪接体

剪接体是由RNA和蛋白质组成的大型动态复合物，在真核生物细胞中执行RNA剪接。它从信使RNA前体（pre-mRNA）中去除内含子，并连接内含子两侧的外显子。其主要组分是小核核糖核蛋白颗粒及众多相关蛋白质，这些组分围绕RNA底物组装并发生重排。剪接通过分支形成和外显子连接两步化学反应完成，而不是简单地切断RNA后再通过独立的修复过程将其连接。(nature.com)

组成与组织

主要剪接体由五种小核RNA（snRNA）及其相关蛋白质组装而成，这五种RNA分别称为U1、U2、U4、U5和U6。每个RNA–蛋白质颗粒都是一个小核核糖核蛋白（snRNP，英语中常读作“snurp”）。U4与U6最初相互配对，其形成的颗粒再与U5结合，构成U4/U6.U5三snRNP复合物。招募这一预先组装好的单元，是构建剪接体的重要步骤。(nature.com)

各snRNA的功能既有区别，也有重叠：

组分 主要作用
U1 在组装早期识别内含子的5′剪接位点。
U2 识别分支点区域，随后参与构建具有催化活性的RNA结构。
U4 在活化前与U6配对；U4与U6的分离使催化结构得以重排。
U5 接触外显子序列，帮助将其定位以便连接。
U6 在U1将5′剪接位点交接给它后，与该位点相互作用，并配位催化所需的金属离子。

这些功能依赖广泛的RNA–RNA及RNA–蛋白质相互作用。因此，成熟的催化装置并不是五个独立发挥作用的颗粒的简单叠加。(nature.com)

剪接体的组成会在其工作周期中发生变化。参与初始识别的蛋白质可能在催化前被移除，而另一些因子则会加入，以稳定已准备好进行反应的构象。人类剪接体的结构表明，与U2相关的SF3B复合物最初将分支点区域固定在远离催化中心的位置；随后的重塑使该区域释放并重新定位。(nature.com)

RNA底物的识别

剪接体必须识别内含子的正确边界，并将这些边界配对。早期识别涉及5′剪接位点和内含子内部的分支点序列，二者分别通过涉及U1和U2的相互作用被选定。分支点腺苷随后直接参与第一步化学反应。识别与催化是两个不同的阶段：RNA区域可以先与正在组装的剪接装置结合，而尚未被定位到能够发生反应的位置。(nature.com)

早期组装可沿两种组织方式进行：

  • **内含子定义：**U1和U2分别结合在同一内含子两端的识别位点。
  • **外显子定义：**U2结合在一个外显子的上游，而U1识别该外显子下游的5′剪接位点。

通过外显子定义形成的组装体，随后必须转变为跨越待去除内含子的组织形式。对人类复合物的结构研究揭示了这一从跨外显子到跨内含子转变过程中的中间态，将初始识别与最终的剪接位点配对联系起来。(nature.com)

组装与活化

剪接体的组装通常通过一系列具有特定名称的复合物来描述。这些名称指的是实验上可区分的不同构象，而不是始终彼此独立的分子机器。

  1. **A复合物，又称预剪接体。**U1和U2建立早期组装体，将选定的5′剪接位点和分支点区域纳入同一个复合物。
  2. **B复合物，又称催化前剪接体。**通过招募U4/U6.U5三snRNP复合物并进行重排，形成更完整的组装体。它已包含剪接所需的组分，但尚未具备催化反应所需的状态。(nature.com)
  3. 已活化的复合物及具备分支反应能力的复合物。RNA和蛋白质的重排建立催化结构，随后将分支点腺苷定位到可参与反应的位置。这两个阶段通常分别称为Bact和B*。在人类剪接体中，RNA解旋酶PRP2和Aquarius依次驱动催化活化的不同步骤。(nature.com)
  4. **C和C*复合物。*C复合物包含分支反应的产物。进一步重塑后，形成能够进行外显子连接的构象，称为C。(nature.com)

许多状态转换会消耗三磷酸腺苷（ATP）。这种能量消耗主要用于分子重塑，包括改变RNA之间的接触以及移除已结合的蛋白质。它应与真正去除内含子并连接外显子的两步化学键交换反应区分开来。(nature.com)

化学机制

剪接体介导的剪接由两步转酯反应组成：每一步都将一个磷酸二酯键交换为另一个磷酸二酯键。

分支形成。分支点腺苷的2′羟基攻击5′剪接位点的磷酸基团。这使上游外显子与内含子分离，并在分支点核苷酸与内含子5′端之间形成2′–5′连接。由此产生的中间体包括一个游离的上游外显子，以及一个仍与下游外显子相连的分支状内含子。这种分支状RNA具有环加尾的构型，称为套索结构。

**外显子连接。**上游外显子新暴露出的3′羟基攻击3′剪接位点的磷酸基团。两个外显子通过常规的3′–5′磷酸二酯键连接，内含子则以套索形式被切除。两步反应使用同一个催化中心，底物重排使该中心能够执行第二步反应。(nature.com)

剪接体是一种以RNA为基础的催化剂，即核酶，其活性依赖蛋白质和金属离子。生化实验表明，U6 RNA在两步反应中都直接负责定位催化所需的金属离子。特别是，将RNA中特定的氧原子替换为硫原子，再检验能与硫配位的金属是否能够恢复反应活性，所得结果证明RNA直接参与催化，而不仅仅充当支架。(nature.com)

产物释放与组分再利用

外显子连接完成后，剪接体并不会立即解体，而是必须先释放剪接后的RNA。酵母实验确定，依赖ATP的因子PRP22在这一过程的后期发挥作用，是释放剪接后信使RNA所必需的。(nature.com)

随后，剩余的含内含子复合物被拆解。在酵母中，套索内含子的释放需要依赖RNA的ATP酶Prp43，这表明产物形成与其后剪接装置的拆解是不同的阶段。产物释放和复合物拆解使剪接体组分得以用于后续轮次的组装。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

主要剪接体与次要剪接体

真核生物的pre-mRNA剪接包含两个相关系统。主要剪接体处理U2型内含子。**次要剪接体**处理少见得多的U12型内含子，并使用U11、U12、U4atac和U6atac分别替代U1、U2、U4和U6；两个系统共用U5。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

次要剪接体采用相近的催化策略，但并非只是主要剪接装置的一个可互换版本。人类次要剪接体活化态的结构显示，U12识别分支点序列，U6atac识别5′剪接位点。该结构还揭示了稳定其独特催化构型的蛋白质。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

可变剪接及其生物学意义

剪接体参与可变剪接，即通过选择不同的剪接位点，从同一个前体产生不同的RNA产物。调控可以发生在早期识别和组装阶段，包括稳定5′剪接位点以及跨外显子组织复合物。因此，剪接装置既执行RNA加工，也提供了可对剪接位点选择进行调控的多个环节。(nature.com)

剪接体组分的变化可以改变这种选择。例如，对U2相关蛋白SF3B1中与癌症相关的突变开展的研究表明，这些突变会改变分支点的使用，并启用替代性3′剪接位点。这一发现将识别装置中的特定分子变化与RNA加工中可重复观察到的变化联系起来；但这并不意味着所有剪接体组分的突变都会产生相同的影响。(nature.com)

发现与结构研究

1985年，生化研究发现了与pre-mRNA剪接相关的大型RNA–蛋白质组装体。爱德华·布罗迪（Edward Brody）和约翰·阿贝尔森（John Abelson）描述了一种酵母复合物，并提出了spliceosome（剪接体）这一名称。同年，葆拉·格拉博夫斯基（Paula Grabowski）、沙伦·塞勒（Sharon Seiler）和菲利普·夏普（Phillip Sharp）报告，在哺乳动物体外实验系统中发现了一种多组分复合物，其中含有RNA前体和特征性的剪接中间体。(pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)

后续的生化和结构研究揭示了其组分如何识别RNA、转换相互作用关系并完成催化。冷冻电子显微术对于观察预剪接体、催化前状态、催化活化状态及外显子连接状态的构象尤为重要。这些结构将分子构造与实验界定的反应阶段联系起来。(nature.com)

不过，结构模型呈现的仍是被捕获的特定状态。人类与酵母的剪接装置具有共同的核心特征，但在某些重塑要求上有所不同，例如Aquarius在人类催化活化过程中发挥额外作用。因此，解释其机制时，必须区分保守的催化原理、不同生物特有的因子，以及通过实验手段稳定的中间态。(nature.com)

参考来源

  1. Prespliceosome structure provides insights into spliceosome assembly and regulationnature.com
  2. Structure of a pre-catalytic spliceosomenature.com
  3. Structural insights into the cross-exon to cross-intron spliceosome switchnature.com
  4. Structural basis of catalytic activation in human splicingnature.com
  5. RNA catalyses nuclear pre-mRNA splicingnature.com
  6. Structure of a spliceosome remodelled for exon ligationnature.com
  7. Requirement of the RNA helicase-like protein PRP22 for release of messenger RNA from spliceosomesnature.com
  8. Prp43 is an essential RNA-dependent ATPase required for release of lariat-intron from the spliceosomepubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  9. Structure of the activated human minor spliceosomepubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  10. Cancer-associated SF3B1 mutations affect alternative splicing by promoting alternative branchpoint usagenature.com
  11. The "spliceosome": yeast pre-messenger RNA associates with a 40S complex in a splicing-dependent reactionpubmed.ncbi.nlm.nih.gov
  12. A multicomponent complex is involved in the splicing of messenger RNA precursorspubmed.ncbi.nlm.nih.gov